自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞 )，是除 T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，甚至参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

图1 NK细胞与其他免疫细胞

NK细胞来源于骨髓造血干细胞，属于先天免疫系统的核心细胞，约占血液中所有免疫细胞数量的15%；主要分布于外周血、肝脏和脾脏。在人体内NK细胞主要特征为CD3−CD56+淋巴细胞群。国际顶级期刊Nature Reviews Drug Discovery (IF=60.716)杂志上的一篇综述，讲述如何利用NK细胞开发肿瘤免疫细胞疗法。

-01-NK细胞生物学

NK细胞发现于20世纪70年代，主要与杀死感染的微生物和恶性转化的同种异体和自体细胞有关。NK细胞来源于CD34+共淋巴祖细胞。据估计，NK细胞的半衰期大约为7~10天，占人类外周血淋巴细胞总数的10-15%，也存在于脾脏、肝脏、肺、骨髓和淋巴结中，它们通过与DC细胞的相互作用发挥关键的免疫调节功能。

NK细胞是第一组固有淋巴样细胞的典型成员，具有分泌 IFN-γ 的能力。终末分化的 NK 细胞缺乏B淋巴细胞（CD19+）和 T 淋巴细胞（CD3+）的表型标记，CD56是NK细胞特征的标志。人外周血NK细胞可分为CD56bright和CD56dim两大类。

NK细胞属于1型先天淋巴细胞，特征之一是产生1型细胞因子（如TNF和IFN-γ）。NK细胞活性受其表面多种激活性受体和抑制性受体（KIR）的调控。激活受体包括：NCR、CD16、NKG2D、DNAM1和信号淋巴细胞激活分子（SLAM）家族受体。抑制性受体包括：免疫球蛋白样受体KIR、NKG2A和白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员。

图1：KIR为人类NK细胞提供多样性、耐受性和学习

大多数正常细胞表达MHC-I，通过激发抑制信号来抑制NK细胞的活性。而肿瘤细胞，则通过降低MHC-I的表达来试图逃避CD8+CTL细胞的识别。如果MHC-I配体的丢失和/或激活性受体的配体表达升高，则会改变NK细胞内的信号通路平衡，从而激活NK细胞，攻击与接触的靶细胞。

-02-如何增强NK细胞功能

图2：NK细胞免疫疗法中的抗体

• 刺激NK细胞的细胞因子

激活性或抑制性细胞因子的拮抗剂，或许是一种策略。比如，IL-2可促进T细胞和NK细胞的激活和增殖。在体外，IL-2可激活NK细胞，然而在体内却受到Treg的抑制。很多公司正在开发选择性激活T细胞和NK细胞的IL-2类似物。比如赛诺菲公司的SAR444245，Alkermes公司开发的nemvaleukin alfa（ALKS 4230），Anaveon公司开发的IL-2R激动剂ANV419等等。

IL-15有望替代IL-2，可刺激NK细胞和CD8+T细胞，但不会激活Treg细胞。目前，多款IL-15重组蛋白正在临床试验中接受测试。其中，ImmunityBio公司的IL-15超级激动剂Anktiva（N-803）已经在治疗膀胱癌、惰性非霍奇金淋巴瘤等疾病的临床试验中获得积极结果。

• 激发ADCC反应的抗体

NK细胞可通过CD16受体介导的ADCC，杀死IgG1或IgG3抗体靶向的细胞。NK细胞表面CD16的不同形态，会影响CD16与抗体Fc端的亲和力。

具体来说，CD16蛋白第158位的氨基酸为苯丙氨酸（158F）时，与Fc的亲和力低，而这一位置上的氨基酸为缬氨酸（158V）时，与Fc的亲和力高。新一代单克隆抗体疗法很多对Fc端进行了修饰，改善了它们与CD16的结合，促进了ADCC的产生。同时，很多抗体在合成时使用了预防抗体Fc端岩藻糖基化的哺乳动物培养系统，增强了它们与CD16的结合。

• 双特异性抗体

双特异性抗体，可同时与激活NK细胞的受体和肿瘤抗原相结合，促进更有效和持久的NK介导细胞毒性。与单抗不同，这些融合蛋白可以被设计成与多种不同的肿瘤抗原和NK受体相结合，并且可以利用抗体可变区片段（Fv）与CD16结合，保证它们可以与158V C16和158F C16有效结合。类似的蛋白设计已经在双特异性T细胞衔接器（BiTE）中得到应用。

目前，Affimed公司开发的AFM13是临床进展最快的CD16双特异性抗体之一。这是一款靶向CD30的双特异性抗体。在治疗霍奇金和非霍奇金淋巴瘤患者的1期临床试验中，它与脐带血来源的NK细胞联用，在治疗的12名患者中，达到100%的客观缓解率。

• 三特异性抗体

三特异性NK细胞衔接器不但可与肿瘤抗原和CD16受体结合，还可包含IL-15，从而与IL-15受体（位于NK细胞表面）相结合，增强NK细胞的活性。三特异性抗体，由于具有同时与不同NK细胞受体结合的潜力，因此正在成为NK细胞免疫疗法的一个令人兴奋的前沿。不过，哪些激活性受体组合能够最大程度增强NK细胞的抗癌活性仍然需要更多研究。

图3.增强NK细胞功能的双特异性和三特异性抗体

-03-过继性NK细胞疗法

NK细胞成为了研究人员开发新型免疫疗法的理想选择之一。目前，正在开发的NK细胞治疗产品主要有两类：一类是自体或是异体NK细胞治疗产品，另一类是CAR-NK产品。

NK细胞的种子细胞来源广泛，包括外周血、脐带血、多能干细胞（ESC和 iPSC）和NK细胞系（如NK92细胞系等） 。iPSC的制备需要种子细胞少，可大量培养，成本较低，可实现自体供给，免疫原性较低。NK92细胞系可无限增殖，对冻融敏感性较低。

NK细胞的不同来源

在增强NK细胞功能方面，在体外培养过程中使用细胞因子进行刺激，常用的细胞因子是IL-2。近年来，IL-12，IL-15， IL-18，IL-21等刺激因子也被用于体外刺激NK细胞，并且能够诱导成长期生存，具有记忆能力的NK细胞。

Affimed公司开发的靶向CD16/CD30双特异性抗体AFM13也可以用于在体外预先与NK细胞结合，促进NK细胞对CD30+淋巴瘤的反应。

CAR-NK可赋予NK细胞靶向特定肿瘤的能力。CAR-NK细胞与CAR-T细胞相比可以提供多种优势，包括细胞因子释放综合征风险（CRS）更小，神经毒性更小。即使CAR-NK细胞失去了CAR，仍然可通过内在表达的激活性受体识别和杀伤肿瘤细胞。

除了CAR-NK，研发人员正在探索增强NK细胞功能的其他基因工程策略，包括通过表达趋化因子受体，促进肿瘤浸润。基于ADCC的疗法可以在NK细胞上表达高亲和力的138V CD16受体，与激发ADCC的抗体联用构成组合疗法。

最后，使用CRISPR-Cas9基因编辑系统可以从NK细胞中敲除副调控因子。这些手段为构建更好的NK细胞疗法提供了多种可能性。

-04-文末小结

NK 细胞具有独特的抗肿瘤效应，不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。

免疫细胞如何发挥作用仍有许多问题尚未解决。而对于实体瘤而言，目前也还并不清楚 NK 细胞是否会比T 细胞更容易地进入实体瘤。NK 细胞可以产生相关细胞因子来吸吸引其他免疫细胞，这可能会进一步增强抗肿瘤反应。

CAR-NK 细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。相信，CAR-NK细胞疗法可能会导致肿瘤免疫治疗的革命性进展。