哈佛大学 Wyss 研究所和瑞士苏黎世联邦理工学院的一个合作研究小组已经在人类基因组序列的动荡海洋中确定了基因组安全港 (GSH)，以将治疗基因放入其中。作为验证的一部分，他们将荧光 GFP 报告基因插入到候选 GSHs 并随着时间的推移跟踪其表达。GSH 可以在未来的基因和细胞疗法中实现更安全、更持久的基因表达。这幅插图为该团队赢得了该研究发表的细胞报告方法问题的封面。图片来源：Erik Aznauryan

哈佛大学 Wyss 研究所、哈佛医学院和苏黎世联邦理工学院的研究人员预测并验证了治疗基因的基因组安全港，从而实现更安全、更有效和可预测的基因和细胞疗法。

许多未来用于治疗癌症、罕见遗传病和其他疾病等疾病的基因和细胞疗法可以通过所谓的“基因组安全港 (GSH)”提高其功效、持久性和可预测性。这些是人类基因组中的着陆点，能够安全地容纳新的治疗基因，而不会导致细胞基因组发生其他可能对患者构成风险的意外变化。

然而，寻找具有临床转化潜力的 GSH 与为航天器寻找月球着陆点一样困难——该着陆点必须位于平坦且平易近人的区域，不能太陡且被大山或悬崖包围，提供良好的能见度，并且能够实现安全返回。同样，GSH 需要通过基因组编辑技术获得，不受基因和其他功能序列等物理障碍的影响，并允许“着陆”治疗基因的高、稳定和安全表达。

到目前为止，仅探索了少数候选 GSH，它们都带有某些警告。它们要么位于基因相对密集的基因组区域，这意味着它们中的一个或几个可能被插入其附近的治疗基因损害其功能，或者它们包含可能无意中在癌症发展中发挥作用的基因活性。此外，尚未分析候选 GSH 是否存在调节元件，这些调节元件虽然不是基因本身，但可以从远处调节基因的表达，也没有分析插入的基因是否会改变整个基因组细胞中的全局基因表达模式。

现在，哈佛大学 Wyss 生物启发工程研究所、哈佛医学院 (HMS) 和瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员合作开发了一种计算方法来识别 GSH 位点，这些位点具有显着更高的安全插入治疗基因的潜力和它们在许多细胞类型中的持久表达。对于 2,000 个预测的 GSH 位点中的两个，该团队提供了深入验证，并考虑了针对皮肤病的过继性 T 细胞疗法和体内基因疗法。通过改造已识别的 GSH 位点，分别在 T 细胞中携带报告基因，在皮肤细胞中携带治疗基因，他们证明了新引入基因的安全和持久表达。该研究发表在Cell Reports Methods上。

“虽然 GSH 可以用作基因靶向的通用着陆平台，从而加快基因和细胞疗法的临床开发，但迄今为止，人类基因组的任何位点都没有得到充分验证，所有这些位点都只能用于研究应用，”该研究的资深作者，Wyss 核心教员 George Church 博士说。“这使得我们对高度验证的 GSH 采取的协作方法向前迈出了重要一步。再加上我们在实验室开发的更有效的靶向基因整合工具，这些 GSH 可以为未来的各种临床翻译工作提供支持。” Church 是 Wyss 研究所合成生物学平台的负责人，麻省理工学院）。

筛选 GSH 的基因组

研究人员首先建立了一个计算管道，使他们能够通过利用来自人类细胞系和组织的大量可用测序数据来预测基因组中可能用作 GSH 的区域。“在这个逐步的全基因组扫描中，我们通过计算排除了编码蛋白质的区域，包括参与肿瘤形成的蛋白质，以及编码某些类型的在基因表达和其他细胞过程中起作用的 RNA 的区域。我们还消除了包含所谓的增强子元件的区域，这些元件通常从远处激活基因的表达，以及包括染色体中心和末端的区域，以避免细胞分裂过程中染色体复制和分离的错误，“首先说——作者 Erik Aznauryan，博士 “这给我们留下了大约 2 个，

Aznauryan 以研究生身份与苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系 Sai Reddy 实验室的其他成员开始了该项目，之后他作为研究生工作的一部分访问了 Church 实验室，在那里他与 Wyss 技术开发研究员 Denitsa Milanova 博士合作.D。此后，他作为博士后研究员加入了 Church 的团队。Reddy 是该合作研究的高级作者和主要作者，是苏黎世联邦理工学院系统和合成免疫学副教授，专注于开发系统和合成生物学的新方法，以设计用于各种研究和临床应用的免疫细胞。

在已确定的 2,000 个 GSH 位点中，研究小组随机选择了 5 个位点，并使用基于 CRISPR-Cas9 的快速有效的基因组编辑策略将报告基因插入到每个细胞系中，并在常见的人类细胞系中对其进行研究。“其中两个 GSH 位点允许插入的报告基因特别高表达——事实上，显着高于团队将相同报告基因工程化到两个早期 GSH 中所达到的表达水平。重要的是，两个 GSH 位点所包含的报告基因并没有上调任何与癌症相关的基因，”Aznauryan 说。这也可能成为可能，因为基因组中的区域在线性DNA中彼此远离 染色体序列，但在三维基因组中，折叠染色体的不同区域相互接触，当插入一个额外的基因时，可能会受到共同影响。

眼科临床翻译

为了评估对细胞和基因治疗感兴趣的人类细胞类型中两个最引人注目的 GSH 位点，研究小组分别在免疫 T 细胞和皮肤细胞中研究了它们。T 细胞用于许多过继细胞疗法，用于治疗癌症和自身免疫性疾病，如果将受体编码基因稳定地插入 GSH，这些疗法可能会更安全。此外，由控制不同皮肤层细胞功能的基因的有害突变引起的皮肤病可能通过将突变基因的健康拷贝插入和长期表达到补充这些层的分裂皮肤细胞的 GSH 中来治愈。

“我们将一个荧光报告基因引入从血液中获得的原代人类 T 细胞中的两个新 GSH，并将一个功能齐全的LAMB3基因（皮肤中的一种细胞外蛋白）引入原代人真皮成纤维细胞的相同 GSH，并观察到持久的活性，”米兰诺娃说。“虽然这些 GSH 具有独特的优势，可以提高治疗用母细胞和子细胞中基因表达的水平和持久性，但我对新兴的‘功能获得’细胞增强功能感到特别兴奋，这些增强功能可以增强细胞和器官的正常功能。因此，安全方面至关重要。” Milanova 与 Wyss 的创业团队合作，正在开发一个基因再生和增强平台，重点是皮肤再生。

“我们在 GSH 工程改造的原代人类 T 细胞中进行的广泛测序分析清楚地表明，这种插入对引起肿瘤促进作用的可能性很小，这在基因修饰细胞用于治疗用途时始终是一个主要问题，”Reddy 说。“正如我们在这里所做的那样，对多个 GSH 位点的识别也支持了构建更先进的细胞疗法的潜力，这些疗法使用多种转基因来编程复杂的细胞反应，这与用于癌症免疫治疗的 T 细胞工程特别相关。”

“这项跨学科合作展示了将计算方法与基因组工程相结合的力量，同时保持对临床翻译的关注。人类基因组中 GSH 的鉴定将极大地增强未来的开发治疗工作，重点是设计更有效和更安全的基因和细胞疗法，”Wyss 创始董事 Donald Ingber 博士说，他也是Judah Folkman HMS 和波士顿儿童医院血管生物学教授，哈佛约翰 A. 保尔森工程与应用科学学院生物工程教授。

参考文献：“发现和验证用于基因和细胞疗法的人类基因组安全港位点”，作者 Erik Aznauryan、Alexander Yermanos、Elvira Kinzina、Anna Devaux、Edo Kapetanovic、Denitsa Milanova、George M. Church 和 Sai T.Reddy，2022 年 1 月 14 日，细胞报告方法。
DOI: 10.1016/j.crmeth.2021.100154

该研究的其他作者是 Reddy 小组的成员 Alexander Yermanos 博士和 Edo Kapetanovic；瑞士巴塞尔大学的 Anna Devaux；以及麻省理工学院麦戈文脑研究所的 Elvira Kinzina。该研究得到了 ETH 研究基金、HMS 的 Helmut Horten 基金会和衰老与长寿相关研究基金以及 Synthego 到 Aznauryan 的 2019 年基因组工程师创新基金的支持。